Las infecciones respiratorias agudas constituyen la causa fundamental de mortalidad y morbilidad a nivel mundial, siendo sus principales agentes causales los virus respiratorios. La detección rápida y precisa de estos patógenos es determinante en el tratamiento y la prevención de las enfermedades que ocasionan. Los métodos moleculares de diagnóstico constituyen herramientas muy útiles por su elevada sensibilidad, especificidad y rapidez en la obtención de los resultados. El presente trabajo se propuso optimizar cuatro  sistemas de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real múltiple para el diagnóstico de 15 virus respiratorios causantes de infección respiratoria aguda, así como introducir el sistema optimizado para el diagnóstico y la vigilancia del laboratorio. Para la optimización de los sistemas de TR-RCPtr se utilizaron 352 exudados nasofaríngeos del período comprendido entre julio–agosto de 2013, y se empleó como prueba de referencia un sistema de TR-RCPpf.  Se determinó la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y negativo e índice de kappa del sistema múltiple en tiempo real. Se calculó la eficiencia de los sistemas simple y múltiple de TR-RCPtr mediante el método de curva de calibración y cálculo de la pendiente. Además, se realizó el diagnóstico de laboratorio en el período comprendido entre septiembre del año 2013 a mayo del año 2014 con la técnica de TR-RCPtr múltiple optimizada. Del total de muestras que se procesaron para la optimización, 162 resultaronpositivas mediante el método en tiempo real, y 112 por el método a punto final. La sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo e índice kappa promedio de la técnica en evaluación fue 100%, 98,4%, 67%, 100% y 0,8 respectivamente. Además, los valores de eficiencia para el sistema múltiple estuvieron dentro del rango de 90,30% a 103,09%, similares a los que se obtuvieron por el sistema simple. La introducción del ensayo optimizado, permitió la detección de 1290 muestras clínicas positivas a virus respiratorios, con el porcentaje mayor de positividad para el virus sincitial respiratorio humano, con un 47,83%. En resumen, el sistema múltiple en tiempo real resultó ser más sensible que el sistema múltiple a punto final y se comportó con valores de eficiencia similares al sistema simple en tiempo real. Estos ensayos optimizados permitieron actualizar el algoritmo para el diagnóstico y la vigilancia de los virus respiratorios en Cuba.